Rev. Peru. Investig. Agropecu. 3(1), e56
ISSN: 2955-8530
e-ISSN: 2955-831X
DOI: 10.56926/repia.v3i1.56
Universidad Nacional Autónoma de Alto Amazonas
Artículo Original / Original Article
Recibido: 15/01/2024
Aceptado: 14/03/2024
Publicado: 20/04/2024
*Juan Carlos Tuesta-Hidalgo - jtuesta@unaaa.du.pe (autor de correspondencia)
©Los autores. Este es un artículo de acceso abierto,
distribuido bajo los términos de la Licencia Creative
Commons Atribución 4.0 Internacional
Validación de una metodología de cuantificación de cafeína
por cromatografía líquida (UHPLC/DAD)
Validation of a methodology for the caffeine quantification by liquid
chromatography (UHPLC/DAD)
Oscar Alejandro Tuesta-Hidalgo1 ; Juan Carlos Tuesta-Hidalgo1* ; Geraldine Morante-Alanya2 ;
Bryan Joel Fermin-Vega2 ; Nadia Rodríguez-Hamamura2 ; Marco Antonio Nureña-Hidalgo1 ;
Enrique Alejandro Barbachan-Ruales3
1Universidad Nacional Autónoma de Alto Amazonas, Yurimaguas, Perú
2Universidad Nacional de Ingeniería, Lima, Perú
3Universidad Nacional de Educación “Enrique Guzmán y Valle”, Lima, Perú
RESUMEN
Se realizó la determinación de cafeína en ocho muestras de café procedentes de diferentes ciudades de la Amazonía
Peruana, Colombia y Ecuador, con el objetivo de desarrollar una metodología para el análisis de rutina del contenido de
cafeína en diversas muestras por cromatografía líquida de alta eficiencia de fase reversa. Este estudio se realizó usando una
fase móvil de agua: metanol (75:25, v/v), a un flujo de 0,3 mL min-1 y una temperatura de 45 °C. La cafeína fue
isocráticamente separada a 3,8 min. Las concentraciones de cafeína en las muestras se determinaron mediante una curva
de calibración con estándar externo, las cuales se encontraron en el rango de 9,74 a 11,12 mg g-1 en café tostado molido,
en 11,08 mg/g en cáscara de café y de 9,17 a 26,59 mg/g en café soluble liofilizado. Se obtuvieron recuperaciones de 68,34,
93,98 y 78,0 % para las fortificaciones de 50, 100 y 150 μg mL-1, respectivamente. Estos resultados indican que la
metodología de cuantificación fue validada a través de un método de separación sencilla y rápida. El estudio permitió
obtener concentraciones de cafeína en muestras de café de la región y sugerir el consumo promedio sin superar los límites
saludables.
Palabras clave: Amazonía; café; cafeína; metodología, UHPLC-DAD
ABSTRACT
The determination of caffeine in eight coffee samples from different cities of the Peruvian Amazon, Colombia, and Ecuador
was carried out developing a methodology for the routine analysis of caffeine content in different samples by reversed-
phase high-performance liquid chromatography. This study used a mobile phase of water: methanol (75:25, v/v), at a flow
rate of 0.3 mL min-1 and a temperature of 45 °C. Caffeine was isocratically separated at 3.8 min. The caffeine concentrations
in the samples were determined by a calibration curve with external standards, which were found to be in the range of 9.74
to 11.12 mg g-1 in roasted ground coffee, at 11.08 mg/g in coffee husk and from 9.17 to 26.59 mg/g in freeze-dried soluble
coffee. 68.34, 93.98, and 78.0 % were recovered for the 50, 100, and 150 μg mL-1 fortifications, respectively. These results
indicate that the quantification methodology was validated through a simple and rapid separation method. The study made
it possible to obtain caffeine concentrations in coffee samples from the region and to suggest average consumption
without exceeding healthy limits.
Keywords: Amazon; coffee; caffeine; methodology, UHPLC-DAD
Cómo citar / Citation: Tuesta-Hidalgo, O. A., Tuesta-Hidalgo, J. C., Morante-Alanya, G., Fermin-Vega, B. J., Rodríguez-Hamamura, N.,
Nureña-Hidalgo, M. A. & Barbachan-Ruales, E. A. (2024). Validación de una metodología de cuantificación de cafeína por cromatografía
líquida (UHPLC/DAD).
Revista Peruana de Investigación Agropecuaria
,
3
(1), e56. https://doi.org/10.56926/repia.v3i1.56
Editor: Dr. Fred William Chu Koo
2 Revista Peruana de Investigación Agropecuaria
Rev. Peru. Investig. Agropecu. 3(1): e56; (Ene-Jun, 2024). e-ISSN: 2955-831X
1. INTRODUCCIÓN
El café, un bien agrícola de vital importancia, impulsa la economía de numerosos países, ocupando
el segundo lugar en términos de comercio internacional después del petróleo (Andrade et al., 2009).
En el contexto peruano, el café se erige como el octavo mayor productor a nivel mundial (Queirolo
Bobadilla, 2011), desempeñando un papel crucial en la subsistencia de alrededor de 223 mil familias,
cuya principal fuente de ingresos proviene de su cultivo en 11 regiones distintas (Del Aguila et al.
2018; MINAGRI, 2018)
Las plantaciones de café en Perú abarcan más de 420 mil hectáreas y suelen cultivarse en sistemas
agroforestales o bajo sombra, contribuyendo así a la mitigación de los impactos del cambio climático
al absorber carbono atmosférico (Ojeda et al., 2019). El café orgánico peruano supone el 10% de la
producción mundial, siendo las variedades arábicas las de mayor difusión en el país (MINAGRI, 2015).
En el año 2021 la producción de café se incrementó en un 17%, siendo las regiones con clima
templado o tropical los que tuvieron mejor rendimiento, aportando en su conjunto el 71,1% de la
producción total nacional (INEI, 2021).
Las variedades de café cultivadas en Perú exhiben cualidades distintivas en términos de color, aroma
y sabor, válidos para la obtención de reconocimiento mundial frente a otras variedades. Estas
cualidades singulares son el resultado de las condiciones edafoclimáticas del área de cultivo, así
como de prácticas de manejo agronómico, densidad de siembra y otros factores (Castro et al., 2004).
Estos elementos influyen en la concentración de los componentes que conforman el café,
especialmente la cafeína.
En este sentido, la producción de café representa una importante fuente de ingresos para
aproximadamente el 30% de la población en la región amazónica peruana (Valdivia, 2021). Una
investigación previa, que empleó cromatografía líquida para cuantificar la concentración de cafeína
en tres variedades de café cultivadas en la Amazonía, reveló que la variedad Caturra exhibió una
concentración de 17,963 mg g-1, el Bourbón 13,200 mg g-1 y la Typica alcanzó 13,587 mg g-1 (Félix
Zamora, 2012).
La cafeína (1,3,7-trimetilxantina) es un compuesto alcaloide derivado natural de la xantina (Müller &
Jacobson, 2011), la cual es altamente conocida debido a su constante presencia en la dieta humana,
principalmente mediante el consumo de gaseosas, bebidas energizantes y café, siendo esta última,
la mayor vía de obtención en varias personas (Mitchell et al., 2014). En respuesta a estos hallazgos,
se han llevado a cabo diversos estudios con el objetivo de determinar los beneficios que el consumo
de café puede aportar a la salud, incluyendo mejoras en el equilibrio energético (Harpaz et al., 2017),
prevenir la fibrosis hepática (Chan et al., 2006) y disminución del riesgo de depresión (Kang et al.,
2018).
Sin embargo, de manera afín existen investigaciones acerca de los efectos adversos en el consumo
de cafeína en altas concentraciones, las cuales han concluido que ingerir menos de 400 mg por día
no representa algún peligro para los adultos no gestantes, mientras que, para las mujeres gestantes,
este límite se encuentra en 200 mg por día (EFSA NDA Panel, 2015), debido a la gran variedad de
problemas que puede llegar a generar en el organismo humano, incluso llegando a causar la muerte
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(Pardo Lozano et al., 2007). El café tostado en grano o molido debe cumplir, según el subcapítulo 6.2
de la NTP 209.028:2015 CAFÉ (INACAL, 2021), que el contenido de cafeína para café sin descafeinar
debe tener como mínimo 1% m/m en base seca y para café descafeinado debe tener como máximo
0.1% m/m en base seca y una humedad de 4 % m/m como máximo. Es por esto que la determinación
de cafeína en muestras de café es necesaria para conocer la cantidad ingerida por los consumidores.
Para ello, se han empleado diferentes métodos para el análisis cuantitativo de cafeína, tales como
métodos espectroscópicos UV-Visible para su determinación en café verde (Navarra et al., 2017),
métodos electroquímicos (Amare & Admassie, 2012) y HPLC para su determinación en café tostado
e instantáneo (Belguidoum et al., 2014). El análisis HPLC es empleado en varios trabajos previos de
determinación de cafeína en tabletas, bebidas energéticas, hojas de té y café (Acheampong et al.,
2016; Gliszczyńska-Świgło & Rybicka, 2015; Nishitani & Sagesaka, 2004; Pokhrel et al., 2016). La
normativa peruana indica como método de ensayo la ISO 4052 (ISO, 1983) y la ISO 20481 (ISO, 2008),
para la cuantificación de cafeína en diversas muestras, es decir, la cromatografía líquida HPLC. A su
vez, existen diferentes métodos de extracción, debido a la presencia de componentes en el café
capaces de generar interferencia al momento del análisis. Por ejemplo, existen métodos como la
extracción líquido-líquido con diclorometano (Belay et al., 2008), extracción empleando fluidos
supercríticos (Sugiyama et al., 1985), también mediante floculación con hexacianoferrato (II) de
potasio trihidratado y cloruro de zinc (Pizzariello et al., 1999), extracción usando soluciones acuosas
de líquidos iónicos a base de colinio (Ferreira et al., 2021). La extracción con óxido de magnesio
ofrece resultados similares a los anteriormente mencionados, pero empleando un menor tiempo
(Khajeh et al., 2017).
Por lo mencionado anteriormente, el presente trabajo busca determinar la concentración de cafeína
en diversas muestras de café de la región amazónica mediante el uso de cromatografía líquida de
ultra alta resolución (UHPLC) utilizando la extracción con óxido de magnesio con asistencia de un
digestor de microondas, y desarrollar un método para el análisis de rutina del contenido de cafeína
en diversas muestras en el Laboratorio de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de
Alto Amazonas, utilizando el equipo implementado en el laboratorio (Cromatografía líquida
UHPLC/DAD). Permitiendo inferir y discutir sobre los resultados y sugerir medidas de prevención en
el consumo de las muestras de café de interés.
2. MATERIALES Y METODOLOGÍA ANALÍTICA
Preparación de reactivos y soluciones
Todos los reactivos usados en este trabajo de investigación son de grado analítico. Las soluciones
fueron preparadas con agua ultrapura (18 M a 25 °C). Cafeína anhidra (Sigma Aldrich, Reagent
Plus), metanol (Merck, grado HPLC), óxido de magnesio (Sigma Aldrich, P.A.).
Preparación de fase móvil y estándares: La fase móvil se preparó mezclando Metanol grado HPLC
y agua ultrapura en una proporción de 25:75 (v/v). Se homogeneizó la mezcla, se filtró (filtro de 0,45
µm), requerido para HPLC, y se sonicó por 10 min.
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Se preparó una solución estándar stock de cafeína a 1000 mg L-1, la cual se usó para obtener una
curva de calibración cuyo rango lineal fue de 10 – 50 mg L-1 cuyo medio fue agua ultrapura y fase
móvil (1:1, v/v).
Muestras de café seleccionadas: Se escogieron ocho muestras de café, la mayoría procedentes de
diferentes localidades de la Amazonía peruana (Lamas, Tingo María, Chachapoyas y Oxapampa),
además de Colombia y Ecuador.
Equipo
El análisis cromatográfico se realizó usando el equipo HPLC Vanquish ThermoScientific (Alemania),
compuesto por una bomba cuaternaria modelo VF-P20, un automuestreador VF-A10, un horno de
columna VH-C10 y un detector de arreglo de diodos (DAD) VF-D11-A. Todos los módulos se
controlaron con el software Xcalibur versión 4.2.47. Todas las separaciones fueron realizadas en una
columna RP C18 (100 mm x 2,1 mm ID, 3 μm partícula). Tanto la parte experimental como el análisis
instrumental de las muestras se realizaron en el Laboratorio de Biotecnología de la Universidad
Nacional Autónoma del Alto Amazonas, 2022.
Parámetros analíticos evaluados
Linealidad: La linealidad del método se evaluó mediante el coeficiente de determinación (R2), el cual
fue calculado analizando la relación entre la concentración de cafeína y el área del pico
correspondiente (Flores Ramos & Ruiz Soto, 2017).
Exactitud: La exactitud del método se reportó en forma de porcentaje de recuperación. Este permite
medir la concordancia entre los valores obtenidos con los valores reales calculados de una muestra.
Para ello, se realizó una fortificación de las muestras con una cantidad conocida de estándar de
cafeína (Rada Mendoza & Salazar, 2011).
Extracción de cafeína: Se pesó 0,50 g de muestra de café con 5,0 g de óxido de magnesio. La cafeína
fue extraída con 40 mL de agua ultrapura a 90 °C dos veces (ISO 20481, 2008), luego fue sonicada
durante 5 min y filtrada. El extracto se llevó a un volumen de 100 mL con agua ultrapura. Se diluyó
1:1 con fase móvil, se filtró con filtros de jeringa de 0,45 µm y se colocaron en viales. Las muestras
se trataron por triplicado.
Condiciones cromatográficas: Las soluciones estándar y las muestras se inyectaron en el sistema
UHPLC bajo las mismas condiciones. La fase móvil empleada fue metanol: agua ultrapura (25:75, v/v).
Una temperatura de columna de 45 °C. Un volumen de inyección de 2.5 μL. Un flujo 0,3 de mL min-
1. La detección se dio a 274 nm (mayor absorbancia de la cafeína) y el tiempo de análisis fue de 5
min. Cada punto de la curva se inyectó por duplicado al sistema. Cada repetición de las muestras se
inyectó por duplicado.
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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de parámetros analíticos de validación
Los resultados obtenidos fueron evaluados en base a diversos parámetros estadísticos como el
coeficiente de regresión y la desviación estándar.
Linealidad: Los estándares de cafeína presentaron un tiempo de retención de 3,7 min., como se
ilustra en la Figura 1, donde se observan los cromatogramas de los estándares preparados de
concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 μg mL-1, los cuales a mayor concentración presentan una
mayor área de pico. Así, se presentó una correlación lineal entre la concentración (10 a 50 µg mL-1)
y el área de pico obteniendo un coeficiente de determinación (R2) igual a 0,9964, lo que se observa
en la Figura 2. Otros parámetros medidos también se muestran en la Tabla 1.
Figura 1.
Cromatogramas de los estándares de cafeína de concentraciones 10, 20, 30, 40 y 50
μ
g
mL-1. El eje horizontal muestra el tiempo de retención en minutos, y el eje vertical muestra la
respuesta en mili unidades de absorbancia
Figura 2.
Curva de calibración de cafeína. El eje horizontal muestra la concentración de cafeína de
la inyección (
μ
g mL-1), y el eje vertical muestra el área pico de los cromatogramas (n=10)
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En la tabla 1 se muestran los parámetros de calidad evaluados a partir de la curva de calibración. En
este sentido se ha demostrado una sensibilidad de 3834,76. El rango lineal de 10 a 50 μg mL-1 y una
buena linealidad que corresponde a un R2 de 0,9964. Lo cual manifiesta una evaluación certera de
cafeína en diferentes muestras en ese rango.
Tabla 1.
Parámetros de ajuste lineal de curva de calibración
Parámetros
Valor
Pendiente
3834,76 ± 81,67
Intercepto
13382 ± 2705,83
Rango lineal (μg mL-1)
10 - 50
Coeficiente de determinación (R2)
0,9964
Límites de detección y cuantificación: Los parámetros de LOD y LOQ fueron 0,68 ± 0,19 y 2,07 ±
0,57 μg mL-1, respectivamente.
Exactitud: Los ensayos de recuperación se llevaron a cabo agregando tres concentraciones (50, 100
y 150 μg mL-1) de estándares de cafeína a la muestra de café proveniente de Lamas (M1), los
resultados se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2.
Eficiencia de recuperación de cafeína en muestra de café proveniente de Lamas (M1)
Medio
Concentración de cafeína fortificada
(μg mL-1)
% Recuperación
M1
50
68,34 ± 2,60
100
93,98 ± 8,19
150
78,90 ± 0,11
De todas las muestras de café estudiadas, las de presentación tostadas molidas, cáscara de café M5
(Oxapampa) y M7 (Colombia) necesitarían un promedio mayor a 4 tazas para exceder el límite de
cafeína establecido por la EFSA en una persona adulta (400 mg) y de 2 tazas para el caso de mujeres
gestantes (200 mg); mientras que las muestras M6 y M8 excederían estos límites con 2 y 1 tazas para
el caso de adultos y mujeres gestantes, respectivamente. Estos resultados son considerando un
contenido en una taza de café de 9 g por 35 mL de agua en su preparación, cantidades que fueron
establecidas por la Asociación de Cafés Especiales (SCA) (Fasman, 2018).
Cuantificación de las muestras: La cuantificación se basó en el método de estándar externo
utilizando curvas de calibración ajustadas por análisis de regresión lineal. El análisis se realizó con 3
repeticiones e inyección por triplicado. Como se observa en la Figura 3, el tiempo de retención de la
cafeína en las muestras de café fue de 3,61 min.
Tuesta-Hidalgo, O. A. et al. 7
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Figura 3.
Cromatogramas de los extractos de las muestras de café. El eje horizontal muestra el
tiempo de retención en minutos, y el eje vertical muestra la respuesta en mili unidades de
absorbancia
En la Tabla 3 se presentan los resultados del contenido de cafeína mediante cromatografía UHPLC
de las 8 muestras de café en tres presentaciones: café tostado molido con una cantidad de cafeína
entre 9,74 y 11,2 mg de cafeína por cada gramo de café, el cual considerando una humedad del 4%
equivale a 1,014 a 1,167% m/m en base seca. La mayor cantidad de mg de cafeína, en este tipo de
café, correspondió a la muestra M4 (Oxapampa-Perú) con 11,12 mg g-1 lo que se significaría contar
con 35,97 g de este café para obtener 400 mg de cafeína por día, puesto que esto representa el
límite de consumo tolerable, siendo similar a lo obtenido en la M5 (Oxapampa-Perú), en la
presentación de cáscara de café.
En las muestras solubles liofilizadas, el contenido de cafeína varía entre 9,17 y 26,59 mg de cafeína
por gramo de café, es decir 0,955 a 2,770% m/m en base seca. La mayor cantidad de mg de cafeína
se obtuvo en la muestra M6 (Ecuador) con 26,59 mg g-1, lo que representaría contar con 15,04 g de
café para obtener el límite permisible de consumo por día; sin embargo, en el café liofilizado de
procedencia peruana (M8), evidenció un alto contenido de cafeína con 23,40 mg g-1, para este caso
se necesitaría contar con 17,09 g de café por día. El café soluble liofilizado procedente de Colombia
es el único que no cumple con el contenido de cafeína según la NTP 209.028.2015 (INACAL, 2021).
De acuerdo a estos resultados, se concuerda con los estudios publicados previamente por EFSA NDA
Panel (2015), que las cantidades promedio de consumo de las muestras de café analizadas deben
ser menores de 400 mg por día para los adultos mayores y 200 mg por día para las mujeres gestantes,
proporciones que se consideran los límites saludables.
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Tabla 3.
Presentación, origen de muestras de café analizadas y su contenido de cafeína (mg g-1 )
Muestra
Presentación
Origen
Cafeína
(mg g-1)
RSD (%)
M1
Tostado molido
Lamas-Perú
10,81 ± 0,01
0,068
M2
Tostado molido
Tingo María-Perú
9,74 ± 0,16
1,600
M3
Tostado molido
Chachapoyas-Perú
10,79 ± 0,13
1,241
M4
Tostado molido
Oxapampa-Perú
11,12 ± 0,45
4,060
M5
Cáscara de café
Oxapampa-Perú
11,08 ± 0,23
2,113
M6
Soluble liofilizado
Ecuador
26,59 ± 3,06
11,521
M7
Soluble liofilizado
Colombia
9,17 ± 0,31
3,353
M8
Soluble liofilizado
Perú
23,40 ± 0,37
1,575
CONCLUSIONES
En el presente trabajo, hemos visto cómo llevar a cabo la determinación analítica de cafeína en café
empleando la técnica de HPLC en el rango lineal de 10 a 50 μg mL-1 con buena linealidad (R2 de
0,9964), LOD y LOQ fueron 0,68 ± 0,19 y 2,07 ± 0,57 μg mL-1 y buena exactitud (80,4% recuperación
promedio) lo cual nos permitirá usar este método para la caracterización de las muestras de café de
la zona, evaluar la calidad referente a la cafeína y sugerir el consumo de café adecuado para ingerir
la cantidad de cafeína óptima que no ponga en riesgo la salud en especial de las mujeres gestantes
y adultos mayores.
Los resultados dan a conocer cuáles de las muestras de café analizadas, cumplen con la norma
técnica peruana respecto a la cafeína (mínimo 1% m/m en base seca) y cuales no cumplen ni la
norma peruana ni la colombiana (0,955% m/m en base seca).
Los resultados obtenidos en esta investigación permitirán a futuro poder hacer un control de calidad
del café de la zona a través de un método validado, con figuras mérito adecuadas y de fácil y rápida
aplicación. Por lo tanto, se sugiere implementar el método de extracción y la metodología de análisis
al Laboratorio de Biotecnología, para análisis de rutina de cafeína en diversas muestras, utilizando el
equipo implementado en el laboratorio de la Universidad Nacional Autónoma de Alto Amazonas
(Cromatografía líquida UHPLC/DAD).
FINANCIAMIENTO
Investigación financiada por la Universidad Nacional Autónoma de Alto Amazonas mediante
Resolución de Comisión Organizadora N° 205-2022-UNAAA/CO.
CONFLICTO DE INTERESES
No existe ningún tipo de conflicto de interés relacionado con la materia del trabajo.
CONTRIBUCIÓN DE AUTORÍA
Conceptualización: Tuesta-Hidalgo, O. A.
Tuesta-Hidalgo, O. A. et al. 9
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Curación de datos: Fermin-Vega, B. J., Morante-Alanya, G. y Nureña-Hidalgo, M. A.
Análisis formal: Tuesta Hidalgo, O. A.
Investigación: Todos los autores.
Metodología: Rodríguez-Hamamura, N.
Supervisión: Tuesta-Hidalgo, J. C. y Barbachan-Ruales, E. A.
Redacción-borrador original: Tuesta-Hidalgo, O. A., Tuesta-Hidalgo, J. C. y Fermin-Vega, B. J.
Redacción-revisión y edición: Todos los autores.
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